礒野　高敬・洲崎　雅史（実験実習支援センター）
਍ഀ 協力：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社　

਍ഀ 　mRNAレベルの遺伝子発現は、PCR(polymerase chain reaction)法が開発されるまでは、放射性同位元素の32Pを用いたノーザンブロットを行って解析していた。RT(reverse transcription)-PCR法を用いれば、自分の研究室で簡単に遺伝子発現を調べられるようになった。当初、PCR法には定量性に問題があるとされていたが、現在では、リアルタイムPCR法を用いればきちんと定量できるようになっており、もはやノーザンブロットを行って遺伝子発現の定量を行う必要がなくなっている。リアルタイムPCR定量法は、もちろんDNA量の定量もでき、また、アレイ解析や次世代シーケンシングの試料の品質管理や検証実験にも必須のものとなっている。
਍ഀ 　今回の実習講義では、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社の協力を得て、実験実習支援センターに設置しているLightCycler®480SystemⅡを用いて、定量的リアルタイム実験について、その原理の講義から実習を通しての解析までを行なう。これからリアルタイムPCRを始めようと考えている初学者から、実際に実験をしているが実験の設計については十分ではない中級者の方向けの内容となっている。਍ഀ
਍ഀ ਍ഀ
਍ഀ

実習講義スケジュール

਍ഀ 【講義パート】
਍ഀ
講義パートではリアルタイムPCR実験を実施するにあたって必要な知識やトラブルシューティングについて解説する。
਍ഀ 　１．リアルタイムPCRの原理
਍ഀ 　２．蛍光フォーマットの選択
਍ഀ 　３．解析法の選択 (絶対定量と相対定量)
਍ഀ 　４．⊿⊿Ct法の計算とPCR効率
਍ഀ 　５．よくあるトラブルとその対策
਍ഀ
਍ഀ 【実習パート】
਍ഀ
実習パートでは相対定量による発現定量解析を行なう。
਍ഀ 　１．マウスcDNAを用いて臓器間の遺伝子発現の定量化
਍ഀ 　２．ターゲット遺伝子とリファレンス遺伝子、キャリブレータサンプルの設定
਍ഀ 　３．LightCycler®480ソフトウェアの操作方法
਍ഀ