■生物活性（あるいは応答）の表し方
●酵素活性の場合＝初速度
　酵素の働きの強さ（触媒能），すなわち，その触媒する反応の速度（基質の減少速度-d[S]/dtや生成物の増加速度d[P]/dt）をその酵素の活性(enzyme activity)という．酵素活性を測定することはその酵素の触媒能の程度や酵素の有効量を知るために必須である．
　酵素反応の速度は，反応時間が経過するにつれて減少する（平衡に近づく）ので，活性測定のためには反応の初期での速度（反応時間を０に外挿した時点での反応速度，初速度initial velocity）が用いられる．初速度を反応速度の指標とすることの意義は，生成物による阻害や反応中に起こりうる酵素の失活の効果を除いて，取り扱いを単純化することである．

　ここで次のような疑問をもつかもしれない．「[P] = 0という点での初速度υを考えている．生成物ができてもいないのに反応速度は測れるのか？」と．答は「できる」．y = 2 xという直線を考える．yは生成物の濃度，xは時間であると思いながら，この直線の傾きを考えよう． x = 0でのyの値は0であるが，x = 0での傾きは２である．言い換えれば，微分dy/dxのx = 0での値は２である．x = 0だからといって，微分量も0になっているわけではない．反応速度は微分量d[P]/dtである．[P] = 0でもυ= d[P]/dtは０ではない．(実際には、[P]0である)

●ホルモンやサイトカインなどの生理活性物質の場合＝平均の応答速度
　生理活性物質の作用を調べる場合も，それら化合物の添加後，適当な時間がたってから（ある時間incubationしてから），目的に応じて特定の化合物を分析・定量している．多くの酵素反応のように連続的に変化を追跡することはまれである．
　当然のことながら，経時変化の十分な検討はすでになされているという前提のもとに，ある任意の勝手に決めた一定時間後に分析している．測定までの時間経過中に，応答にlagはあったのか，そうではなく直線的に変化したのか，あるいはピーク（極大値）を示したのか．もし経時変化の全体的パターンが不明なら，結論を誤るかもしれない．なぜなら，一定時間当たりの変化量（平均の応答速度）だけを観測しているだけだから．このことをしっかりと肝に銘じておこう．

●絶対測定と相対測定
　例：ある臓器で物質Ｘを定量し（絶対測定），それをコントロールに対する百分率で表し（相対測定），処置の効果を判定した．ところが，コントロールでの物質Ｘの絶対的含有量(〜nmol/g wet weight)に疑義があった．

■試薬の混合順序が活性に影響することがある
●難溶性の試薬
　水に難溶性の試薬（ブロッカーなど）を溶かすため，detergentや有機溶媒（エタノール，アセトンなど）を用いることがある．
　このdetergentや有機溶媒がタンパク質と相互作用し，タンパク質の立体構造が変化し，その結果，活性も変わることがある．あるいは，反応容器に難溶性試薬が強く吸着し有効濃度が減少したり，次の実験のときにそれが吸着面から時間とともにゆっくりと溶け出すことがある．

●試薬間での反応や相互作用
　試薬同士が反応する．塩の形成など（Ｃａイオンとリン酸イオン）

■定数を求めるときの濃度の選び方
●比活性あるいはstandard assayの実験条件の決め方
　酵素を取り扱う際，しばしば比活性を測定する必要にせまられる．実験には必ず誤差が伴うが，これをできる限り少なくしなければならない．そのために以下のことに留意する．

1. ［Ｓ］を Ｋm の値より十分大きくする．
   　基質の溶解度に問題がなければ，υ は Ｖmax の 90％以上になるように基質濃度［Ｓ］を選ぶ．
   
   　下の式より，［Ｓ］は Ｋm の値の９倍以上にする．
   
   υ　＝　Ｖmax［Ｓ］／Ｋm＋［Ｓ］　→
   
   　υ ／Ｖmax 　＝　［Ｓ］／Ｋm＋［Ｓ］　＝　0.9
   
   
2. 酵素の安定性に問題がなければ，ｐＨは最適ｐＨにする．
   

　こうすれば，［Ｓ］やｐＨが少し違っていても，測定値であるυの値は大きく変わらない．
●Ｋm や Ｖmax の値を求めるための実験のやり方

　基本方針：

・誤差を少なくするために，Ｋm の値を実験値がはさむようにする．

・生データのυ−［Ｓ］plotは必ずとる．

・定数の算出にはLineweaver-Burk plotはなるべく用いない．

1. まず，適当な二点の基質濃度で，初速度を測定する
   
2. 適当な線形プロットを用いて，その二点を結び，Ｋm の値を読みとる
   
3. 読みとった Ｋm の値を参考にして，次に実験する基質濃度を決める
   
4. ３つの測定値を目で最小自乗し，そのときの Ｋm の値を読みとる
   
5. その Ｋm の値を参考にして，次の［Ｓ］を決める
   
6. これを繰り返す
   

　このとき，同時に生データであるυ−［Ｓ］plotを必ずとる．これはたいへん重要である．
　実験者には（無意識下で）線形プロットをしているという意識があり，手には直定規をもっている．その物差しをデータポイントにあてる．この時点であなたは，この酵素反応はMichaelis-Menten型（allostericな挙動はない）としている．なぜなら直線をひいているのだから．特に1／υ−1／［Ｓ］plotの場合，直線に読みとってしまう．このplotは危険なplotである．統計的にも各基質濃度での誤差が一様でなく，allostericな振る舞いを見落としてしまう．
　Ｋm や Ｖmax を求めるときは，Eisenthal−Cornish-Bowdenのdirect linear plotやHanes-Woolf plot ([S]/v-[S] plot)を用いる．Lineweaver-Burk plotは阻害のパターンの判定などに用いて，定数の算出には用いない．

例１：L-B plotでplotが横軸(1/S軸)と平行になり，Ｋmが求められないと，相談を受けた．
例２：L-B plotでplotが上に凸であるのに，直線をあてはめてしまった．
例３：plotを統計解析のソフトで処理（多項式でfitting）し，その理論的根拠を尋ねられた．

■「定数」の意味について
●定数には，実験条件が変わっても不変である定数と，そうでない定数の二種類がある
　１）普遍定数(universal constant)
　基本法則を表す式において，関与する対象の個々の種類および状態に関係なく，つねに一定の値を保つ定数：アボガドロ定数，ボルツマン定数，プランクの定数，光速度定数（真空中の光速度），…
　２）ある一定の条件のもとで一定である定数
　比活性，Ｋm，Ｖmax，速度定数，受容体や酵素へのリガンドの結合定数や解離定数．これらの値は，ｐＨ・温度・イオン強度など熱力学的条件が変わると変化する（これら条件の関数である）． ●定数や物理量の単位について
　M-M式，v＝VS/[Km + S]，の分母は Km + S であり，Sの単位はモル濃度であるから，Kmの単位も当然モル濃度である．同じ単位でなければ，足すことはできない．分母の単位のモル濃度と分子のSの単位のモル濃度は互いに消去して，M-M式の単位は，vの単位＝Vの単位，すなわち，化学反応の速度の単位となる．
　阻害剤の解離定数は反応の平衡定数であり，その単位は濃度であるが，平衡定数の単位は濃度とは限らず，濃度の逆数であったり，無名数であったりする．
　もう一つの例：気体の状態方程式 PV = nRT の話

■effectorやfactorの添加で活性が上昇したからといって，「活性化」したとは限らない
　シグナルが細胞に伝達され，protein kinaseが活性化され，酵素Ｅがリン酸化されたとする．その結果Ｋm・Ｖmaxともに低下したとする．この場合，実験で用いる［Ｓ］の値によって，活性は上がるか，変わらないか，下がるか，どれでも好きなものすることができる．Ｅのリン酸化によって，Ｋm とＶmax がともに大きくなったときも，全く同じように，［Ｓ］の値の選び方によって活性の変化を好きにしうる．
　活性化，不活性化はＫm とＶmax しだいである．したがって，今問題となっている酵素のkinetic parametersの値は測定しておかなければ，結論を誤るかもしれない．

　酵素のリン酸化・脱リン酸化に伴って，酵素は活性型や不活性化型に変換する．このようにtextに記載されているが，不活性型酵素で活性が０である，あるいは活性型に比較して，非常に活性が低いという例はほとんどない．活性の差はわずかである．しかし，応答としての代謝の流量は大きく変化する．

■活性化や不活性化を定量的に取り扱って，考えるということ
　ある酵素の活性がリン酸化で上がった，あるいは，下がったといって，それだけで代謝の向きは説明できても，その量（代謝の流量）は説明できない．
　また，ある反応のアロステリックエフェクターの濃度が増えたといって，流量変化の向きは説明できても，その量的変化はそれだけでは説明できない．
　例：解糖系の調節

■扱っているeffectorやfactorと拮抗するfactorを添加してみること
　拮抗する作用をもつfactorを量を変えて添加し，実験する．
　　例：insulinとglucagon
　　　in vivoで，[insulin]＝0あるいは[glucagon]＝0とはならないので．

■effectorやfactor添加後の時間変化

1. effectorやfactorは実験中，化学的に安定であったか
   

例：

カテコールアミン → 酸化され重合する．

ペプチド系のホルモンやeffector → 分解される．

これらのmetaboliteや反応物が有効なときがある．

例：

トリプトファンの分解系→ＭＡＯの阻害．

極端に長時間であると思うincubationをする．

例：

High Glucoseによるタンパク質の糖化．

●ヒステリーシス現象・履歴酵素−もう１つのアロステリック効果（協同現象）
●アロステリック現象の概念の拡張
　酵素反応のυ-［Ｓ］曲線やタンパク質へのリガンドの結合曲線は，直角双曲線を示すタイプとそれとは異なるタイプ（たとえばＳ字状）の２つに大別される．非双曲線は，タンパク質の立体構造の変化あるいはその結果としての結合部位間の相互作用に起因し，協同性(cooperativity) あるいはアロステリック効果が認められるという．この現象は生体機能の調節機構の１つとして重要であり，現在ではモノーら（1963年）による原義である“立体構造上（空間的に）異なる部位”をはなれて，広くアロステリー (allostery) またはアロステリズム (allosterism) と呼ばれる．

■生理活性物質（基質・ホルモン・サイトカインなど）の濃度に対する生物応答のパターンは５（＋１）種類に分類される
　ある物質の濃度（用量）とそれによってひき起こされた反応の強さ（応答）との間の関係は，

・υ-［Ｓ］ curve（酵素反応）

・binding curve（受容体などタンパク質へのリガンドの結合）

・saturation curve（〃）

・dose-response curve（薬理学での濃度(用量)−反応曲線）

などとよばれる．
　これらの曲線は，縦軸に反応の強さをとり横軸に化合物の濃度（遊離濃度）をとって表されるのが普通である．曲線のパターンには次の５つのタイプがある．

1. 直角双曲線（協同性なし）
   
2. Ｓ字状曲線（狭義のアロステリック効果，正の協同性）
   
3. リガンド濃度の低い領域で急激に立ち上がり，飽和状態への達し方が非常に緩やかな曲線（負の協同性）
   
4. 結合(飽和)曲線の途中に平坦部(肩)あるいはピークを示す bumpy curve
   
5. あるリガンド濃度で反応は最大となり，その後減少する曲線（酵素反応では基質阻害のパターン）
   
6. 直線
   

　自分の行っている実験系が，これらのどのパターンに属するのかを知っていなければならない．そのためには曲線全体にわたる実験データが必要である．

■理論式中の生理活性物質の濃度は，ふつう全濃度でなく，遊離の濃度である
●多くの酵素反応の実験では［Ｓ］［Ｓ］t と近似できる
　基質の全濃度［Ｓ］t は，遊離の濃度［Ｓ］，酵素に結合しているものの濃度［ＥＳ］，および生成物の濃度［Ｐ］の和で表される．

　　［Ｓ］t ＝ ［Ｓ］ ＋ ［ＥＳ］ ＋ ［Ｐ］

ふつう酵素活性を測定するときは，酵素の全濃度［Ｅ］t に対して基質の全濃度［Ｓ］t は十分に大きいので（［Ｓ］t >>［Ｅ］t)，たとえすべての酵素に基質が結合したとしても［Ｓ］>>［ＥＳ］である．さらに反応の初速度を考えているから［Ｐ］ ０である．
　したがって，通常の実験では［Ｓ］［Ｓ］t と近似でき，Michaelis-Mentenの式も次のように書ける．

　　υ　＝　Ｖmax［Ｓ］／Ｋm＋［Ｓ］　→ 　υ　＝　Ｖmax［Ｓ］t ／Ｋm＋［Ｓ］t

　例：基質の全濃度［Ｓ］t が，酵素の全濃度［Ｅ］t よりも1,000倍以上の桁が高いとしよう．［Ｓ］t >>［Ｅ］t であり，［Ｓ］［Ｓ］t と近似できる．今，［Ｓ］t ＝１，［Ｅ］t ＝0.001とする．酵素すべてに基質が結合したとすると，遊離の基質濃度［Ｓ］は0.999となる．我々の行う通常の実験では有効数字は２桁ないし３桁であるので，［Ｓ］［Ｓ］t と近似できるわけである．

　ちなみに，有効数字を３桁にすると，我々は重さ・体積・温度・時間などすべての実験条件を４桁目まで制御しなければならない．普通の生化学の研究室ではかなり困難である．


●多くのホルモンやサイトカインの実験では［Ｌ］［Ｌ］t と近似できない
　ホルモン・サイトカインなどの生理活性物質を用いる多くの実験系では，これらリガンドの濃度は酵素反応の場合の基質の濃度に比べ，非常に低い濃度であり，［Ｌ］［Ｌ］t と近似できない場合が多い．注意しよう．
　このため，スキャッチャードプロット(Scatchard Plot)などで解析するとき，遊離（非結合）のリガンド濃度を直接的に測定するか，計算で求めなければならない．

●酵素反応の実験で［Ｓ］［Ｓ］t と近似できない場合の計算法
　酵素の活性が低く，活性測定の際，大量の酵素を用いる必要があり，実験的に ［Ｓ］t >>［Ｅ］t とできない，つまり［Ｓ］［Ｓ］t とできない場合がある．このときの［Ｓ］の求め方を以下に示す．（我々の知っている量は［Ｓ］t と，そのときのυの値，それに［Ｅ］t だけである）

［Ｓ］t＝［Ｓ］＋［ＥＳ］＋［Ｐ］ 　∴［Ｓ］＝［Ｓ］t − ［ＥＳ］			（初速度 →［Ｐ］ ０）	（１）
υ ＝ kcat［ＥＳ］ 　　Ｖmax ＝ kcat［Ｅ］t		→	υ／Ｖmax　＝［ＥＳ］／［Ｅ］t　 　　　　　　＝　ｒ（飽和度）	（２）
∴［ＥＳ］ ＝　ｒ［Ｅ］t				（３）
（３）式を（１）式に代入して，
［Ｓ］＝［Ｓ］t　−　ｒ［Ｅ］t				（４）

1. 1／υ−1／［Ｓ］plotでＶmax の値を外挿で求める．
   
2. （２）式に基づいて，υ/Ｖmax からｒを計算する．
   
3. （４）式を用いて［Ｓ］を求める．
   
4. この［Ｓ］を用いて，酵素反応速度を解析する．
   

　（２）式からわかるように，υ/Ｖmax が基質Ｓによる酵素の飽和度ｒを表わしているので，酵素反応速度υを測定するということは，酵素Ｅへの基質Ｓの結合を速度を通してモニターしているということになる．ちなみに，ここでの考え方は酵素反応速度論におけるυ／［Ｓ］-υプロット (Eadie-Hofstee plot)やScatchard Plot (ｎ＝１)の場合と同じである．

Eadie-Hofstee の式
　υ／［Ｓ］　＝　Ｖmax／Ｋm　−　υ／Ｋm

Scatchard の式(ｎ＝１の場合)
　ｒ／［Ｓ］　＝　１／Ｋm　−　ｒ／Ｋm

■酵素反応での拮抗阻害
●反応のスキームやモデルを書き下すということ
　拮抗阻害のモデルは text には次のように書かれている．

Ｅ ＋ Ｓ　　ＥＳ　　Ｅ ＋ Ｐ Ｅ ＋ Ｉ　　ＥＩ

このモデルの意味は，同一酵素形，この場合は「Ｅ」という記号で表される酵素の種類に，基質Ｓも阻害剤Ｉも結合しうる．そしてＥＩやＥＳには，それぞれさらにＳやＩは結合できず（ＥＳＩという複合体はない），ＥＩはさらにＥＩ’（ＥＩ　ＥＩ’）のように反応しないことを示しているにすぎない．

・Ｅ，Ｓ，Ｐともにその存在状態はそれぞれ１種類しかない．Ｅ’などはない．
・ＥとＳは１対１で結合し，ＥＳ中間体は１種類しかない．
・反応 Ｅ ＋ ＳＥＳ，反応 ＥＳＥ ＋ Ｐ は可逆反応である．
・Ｅは反応後，再生する．すなわちＥは触媒である．
・反応を左→右，右→左と見ても同じである．ＳとＰを入れかえても同じで，対称的である．
・ＳがＥによらずＰに変化することはできない．ＥＳという中間体を経なければならない．Ｓ→Ｐという自発的反応はない．
・ＥとＩは１対１で結合し，ＥＩ中間体は１種類しかない．
・反応 Ｅ ＋ ＩＥＩ は可逆反応である．


　ここで，たとえば，阻害剤Ｉが基質Ｓの結合部位以外に結合し，その結果，酵素の構造が変化し，ＥＩはＳを結合できなくなってもよい．この場合もその実験結果は上の式で表される．「拮抗」というイメージと上の式で表されたモデルとは別である．上の式は「拮抗阻害」と我々が名づけた酵素の阻害現象もその１つとして含むだけである．繰り返すが，拮抗阻害ならば上の式で表されるが，逆に上の式は拮抗阻害のみを表しているわけではない．
　したがって，L-B plot（実験結果）が図のようになったからといって，直ちに化合物Ｉは基質の結合部位に基質と競合して結合するとは結論できない．図の結果は確定証明ではないことに注意．ＥＩ複合体のＸ線結晶解析で，活性部位の基質結合部位に化合物Ｉが１分子結合し，酵素の他の部位には結合していないというデータがあれば，Ｉは拮抗阻害剤であると結論されよう．こういう意味において，kineticsには限界があることを明確に意識しておくことは重要である．他の実験方法においても同様である．それぞれの方法の限界を知るべし．
●基質の結合部位に結合するのに「拮抗阻害」を示さない例
　１つの基質Ｓが１つの生成物Ｐに変化するという酵素反応（Ｓ → Ｐ）は非常に少ない．あるいはないといっても過言でない．多くの酵素反応では基質，生成物ともに２つ以上である．
　さて，ここで２基質反応系の１つであるlactate dehydrogenase (LDH)を考える．
　　ピルビン酸 ＋ ＮＡＤＨ ＋ Ｈイオン（Ｈ+）　　乳酸 ＋ ＮＡＤイオン（ＮＡＤ+）
ピルビン酸の還元による乳酸の生成反応を見ている場合（ピルビン酸 → 乳酸），オキサミン酸oxamateはピルビン酸と「拮抗」する阻害剤である．しかし，同じピルビン酸の結合部位に結合するシュウ酸oxalateは「拮抗阻害」をせず，いわゆる「非拮抗阻害」をする．
　ＬＤＨの反応機構は定序逐次機構(ordered sequential mechanism)であり，ピルビン酸とoxamateはＥ-ＮＡＤＨという同じ酵素形に結合しうるが，oxalateは異なる酵素形であるＥ-ＮＡＤ+のピルビン酸結合部位に結合する．oxalateは非拮抗阻害を示すが，その結合部位は基質であるピルビン酸と同じ場所である．
　逆に，乳酸の酸化（乳酸→ピルビン酸）の反応を観察しているときには，oxalateは乳酸と拮抗する．
　「拮抗」という言葉は，基質と阻害剤が酵素の同じ部位を取り合うというイメージに対して，人がその現象に勝手につけたものであることに注意しよう．

■反応系や応答のモデルをたてたとき，それが意味すること
　実験的研究においては先に式があるのではなく，まず第一に実験データ・実験事実があるのである．これは大切なことである．実験事実を積み重ねて，モデル・スキーム・式を作り上げる．そのモデル・式から今度は演繹的に予想・予測を導き出す．それをさらに実験的に確かめる．こうして，いろんな実験事実から最終的にモデルを書き下す．その時点でその研究は９０％以上終わったも同然である．
　このことは何もkineticsに限ったことではない．たとえば，cell biologyのような分野で定性的な実験をしたとする．ある化合物Ｘの影響を培養細胞で観察し，ある細胞応答の増大があったとする．その時間経過がlagを示しＳ字状に増加したのか，あるいはそうでなかったのか．このような実験から定性的にモデル（機構に関する考え＝推論）をたてる．それに基づいて，定量的に考えを進め，実験・研究を展開する．当然，モデルによってそのやり方は変わってくる．こうして，帰納・演繹を繰り返しながら，スキーム・モデルを精密にしていき，研究を展開し，自然を解明していく．

●「 Ｅ ＋ Ｓ　　ＥＳ　→　Ｅ ＋ Ｐ 」というモデルの意味すること

1. １つの基質Ｓが１つの生成物Ｐに変化する．
   
2. Ｅは反応後，再生する．すなわち，Ｅは触媒である．
   
3. Ｅ，Ｓ，Ｐともに，その存在状態はそれぞれ１種類しかない．Ｅ'などはない．
   
4. ＥとＳは１対１で結合し，ＥＳ中間体は１種類しかない．
   
5. 反応　Ｅ ＋ ＳＥＳ　は可逆反応であるが，反応　ＥＳ → Ｅ ＋ Ｐ　は不可逆反応である．全体として不可逆反応である．
   
6. ＳがＥによらずＰに変化することはできない．ＥＳという中間体を経なければならない．Ｓ→Ｐという自発的反応はない．
   
   

●「 Ｅ ＋ Ｓ　　ＥＳ　　Ｅ ＋ Ｐ 」というモデルの意味すること

5. 反応　Ｅ ＋ ＳＥＳ，反応　ＥＳＥ ＋ Ｐ　は可逆反応である．全体として可逆反応である．
   

7. 反応を左→右，右→左と見ても同じである．ＳとＰを入れかえても同じ．対称的である．
   

図は、当日配布の資料をご参照下さい。