1. 顕微鏡トモグラフィ（光学的断層像 optical section、共焦点画像 confocal image）とは

　実際に組織を切ることなく、光学的な連続断層像の得られる顕微鏡トモグラフィは、共焦点レーザ走査顕微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)の実用化によって可能になった。生物系に応用する場合はレーザを蛍光物質の励起に用い、蛍光シグナルを検出する。

1) 光源の問題：光源としてのレーザ光と水銀ランプの違い
　一般に放電管から出る光は励起状態にある多数のガス原子の電子が基底状態にもどる過程で起こる光の自然放射によるため、波長も位相もまちまちである。水銀ランプでは、紫外領域から赤外にわたる連続スペクトルと、水銀に由来する、輝度の高い不連続的な輝線スペクトルを放射する。（輝線スペクトルに合わせて励起光の波長を設定していあるので、効率よく励起できる。）一方レーザは、励起状態の電子に強い光を照射することにより照射光と同じ、波長の光が放出される、誘導放射によるため、位相の連続した、方向性のある限られた範囲の波長の光が得られる（図３ａ）。波長域が限られているので、多重染色に対しては、複数のレーザ光源が必要な場合がある。

2) 共焦点系
　光学的な断層像を得るためには、焦点面からくる光のみを検出する必要がある。このために採用されたのが共焦点系である。共焦点系は、対物レンズに対して光源と共役の位置に検出器（フォトマル）を配置したものである。よく用いられている落射型の光学系では、光源から出る励起光と検出器に入射する蛍光を分けるために、ダイクロイックミラーが使われている。このミラーのおかげで、図１ａに示すように、同一のレンズを対物レンズとコンデンサーレンズとして用いることができる。最も重要な点は、共焦点系の光源および検出器と対物レンズとの間にピンホールを置くことによって、焦点面以外からの迷光を遮断できることである。ただ、光源はピンホールを通して点光源となるので、焦点面全体の断層像を見るためには点光源を小型のガルバノメータ・ミラーで高速で振って標本上を走査しなければならない（図１ｂ）。更に連続断層像を得るためには、走査の度に試料ステージを一定のピッチで上下させる機構が必要である。
　実験センターのCLSM (Biorad MRC600：図２)では共焦点無限遠光学系を用いている。試料から検出器までの間を長くし、試料から出た光はほとんど平行光束にして、大きな像を得ることができ、また検出器の手前のピンホールも大きなものを使うことができる（ピンホール径の調節が容易）。ピンホールを大きくすると像が明るくなるが、焦点深度が深くなり、共焦点効果（焦点面以外からの光の遮断効果）は減少する。

3) 多重染色への対応
　実験センターのCLSMには、従来のクリプトン・アルゴンレーザに加えて、昨年度末に紫外レーザが増設され、DAPI、FITC、TRITCの3色の蛍光に対応できるようになった（図３）。これにより、核染色以外に、2種のシグナルの検出が可能となり、FISHによる染色体の構造解析などもできるようになった。しかし、現時点ではいくつかの問題点もある。

(1)

　紫外光の場合、色収差（波長の違いによる焦点面のズレ）が問題になる。この補正には紫外領域に対応した高価な対物レンズが必要であるが、本器では通常のdry 40倍対物レンズに対応する補正光路に紫外光を通し、レーザ光の入射角を変えることにより、ある程度のズレの補正をしている。

(2)

　3色で標識した試料から、発する異なる3種類の光を同時に検出するには3本のフォトマルが必要であるが、 現時点では2本しかないので、（フルサイズの画像を得るためには）1色づつ3回に分けてトモグラフィをとらなければならない。 その間、ステップモーターが正確に作動して同一の焦点面での画像がとれていなければならない。

2. 顕微鏡トモグラフィの特長と問題点

1) 顕微鏡トモグラフィの実用上の特長

(1)

　組織を切らないで光学的に0.2 μm程度までの間隔で連続断層像が得られるだけでなく、

(2)

　画像を繰り返し取り込み、加算することによってノイズを相殺させると共に特異的なシグナルを増強できる、

(3)

　画像データを光磁気(MO)ディスクに取り込み、自由に画像処理ができる（例えば通常の標本では観察できない標本の厚み（z軸）方向の断層像も合成できる）、

(4)

　十分に薄い断層像によって構造の厚みに影響されない、物質の濃度情報を得ることができる、などがある。

(1)

　観察できる試料の厚さに限界がある。これは、抗体やprobeの浸透性が影響するが、それ以外に、励起光の吸収や散乱の強い試料では深部のシグナルの検出が困難になる。また、組織内に屈折率の違いがあると、その界面で光の反射が起こったりする。

(2)

　この特性は、波長によって程度が異なるので、異なる波長の蛍光シグナルを定量的に比較する場合に注意を要する。

3. 実際の使用法

1) 電源on
　レーザが安定するまで5分ほどかかる。紫外レーザをつけるときは、冷却水を流してから。
2) フィルタブロックの選択

3) 光軸の確認。

4) まず、水銀ランプで励起して、CLSMで観察する箇所を探す。光路をA(eye piece 100%)にする。シグナルの色に応じてフィルターボックスを選択する。

5) confocal imageをとる。

1. フィルタボックスを外し、光路をAからC(side 100%)に切り替える。
   
2. 対物レンズの倍率、ズーム率、scan speed、フォトマルのチャンネル(1:長波長 or 2:短波長 or both)、Kalman（画像の加算回数: 3-5回）の設定
   -　ゆっくりscanしてもKalmanと同じ効果が得られる。
   
3. confocal imageをdirect modeでとり、明るさを調節する。
   -　実際は、検出器（photomal）の感度はmaximumにしてある。明るさはレーザ光の強さを透過率の異なるNDフィルターで調節するか、検出器の手前のピンホールの径を変えることで調節する。（レーザは出力を最大にして使用する。）
   -　3色のシグナルを検出するには、1色ずつ、3つの画像ファイルとする。
   
4. 画像のMOディスクへの保存(MO: D drive): File　→　Saveをクリック。
   （byteに設定されていることを確認する。）

1. focus motorをonにしたら、positionボタンでステージを上下させる。
   
2. Z step（正の値になっていることを確認する）、Z start、Z stopの設定。
   
3. Collect→Z series/time seriesをクリック。

7) 異なるチャンネルの画像をmergeする。

1. COMOSのMerge file, Merge sideを使う：2色まで。
   
2. 3色のMergeは、COMOSを終了して、Confocal ASsistantを使う。
   
3. 画像をMacに取り込んで、Photoshop上でmergeする。

8) 終了

1. MOディスクを抜く。
   
2. 電源を切る。
   
3. 試料を外してレンズを拭く。油浸の対物レンズは必ずしっかり拭くこと。外しておく方が望ましい。（レンズ内にオイルが逆流すると見えなくなる。）
   
4. filterを外して収納する。