Polymerase Chain Reaction　(PCR) 法は、分子生物学のみならず、医学を始め生物学全体に広く浸透し、更に、新たな応用法が開発 され適応範囲を広げようとしている。本講義では、PCR法の活用法を、講師が実際に行った事例を紹介しながら解説する。また、PCR法を 用いるうえで、決定的な役割を演じるプライマーの設計法についても解説するとともに、実際に設計の演習を行う。ご自分の研究対象の 遺伝子のためのプライマー設計も歓迎します。

PCR法の活用法
１）ウイルス遺伝子の検出
　成人Ｔ細胞白血病ウイルス（HTLV-I）、単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1)に対するプライマーを作製し、ウイルスに感染しているか どうかを判定した。ドットブロット法で、ウイルス遺伝子の半定量も行った。微量なウイルス遺伝子の検出には、プライマーの 出来不出来が大きく効いた。市販のプライマー及び文献上のプライマーが必ずしもいいものではなかった。

２）RT-PCR
　RNAを逆転写酵素（reverse transcriptase [RT]）で、cDNAに変えて、遺伝子発現を調べるPCR法。サイトカインや ウイルス遺伝子の発現の解析に用いた。定性的解析でも、定量的解析でも、RT反応をしていないRNA試料についてもPCR反応を行い、 DNAのコンタミが無いことを確かめることが重要である。また、定量的解析では、試料ごとのばらつきが必ずと言っていいほどあるので 、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) 遺伝子等の内部コントロールのRT-PCRを行い、標準化することが重要である。定量は、以前は、RI標識してデンシトメーターを用いていたが、今は、エチブロ染色で定量出来る実験センターの装置を用いて行っている。

３）PCRインビトロクローニング
　講師は、ウイルス腫瘍のウサギのモデルを扱う中で、既存の免疫関連遺伝子のウサギのホモログ遺伝子を、ヒト、 マウス等の他種のDNA塩基配列の情報に基づいてプライマーを作製して、PCRインビトロクローニングを行ってきた。 ホモログ遺伝子のクローニングには、アミノ酸配列に基づきジェネレイトプライマーが使用されることが多いが、 プライマー同士の会合が起こりやすくうまく行かない場合が多いので、講師は、ホモロジーの高い配列部分のヒトの配列でプライマーを 作製しておおむねうまくいっている。PCRは、プライマーが100％一致しなくても、善悪にかかわらず増幅が起こるものである。 特異性を上げるため、ネスティドPCRができるようにプライマーペアを2組作製している。

４）PCR法を用いた遺伝子歩行
　既知のDNA塩基配列の前後の塩基配列を決定したい場合がある。PCRを用いてそれを決める方法がいろいろと開発されている。 講師は、cDNA 及びゲノムDNAを制限酵素処理した後、カセットをライゲーション反応で結合させた後、既知の配列特異的な プライマーとカセットの配列に特異的なプライマーでPCRを行い、遺伝子歩行を行うcassette-ligation mediated PCR法を主に 用いている。他に、terminal deoxynucleotidyl transferase を用いる anchored PCR法や、制限酵素処理したDNAを ライゲーション反応で環状化した後、既知の配列特異的なプライマーペアを、既知の配列の外側に延びるように1組作製して PCRを行う inverse PCR 法も用いている。

５）その他のPCR 法の活用法
　トランスフォームした大腸菌のインサートを確認するのには、colony PCR が有効であり、クローニングしたファージの インサートを確認するのには、plaque PCR が有効である。融合タンパク質を作製するためのインサートを作製するのには、 インサートのために必要な制限酵素部位を持つプライマーペアを1組作製し、PCR を用いるのが簡単である。

　以上、PCR 法の活用法をいろいろと紹介したが、いずれの場合もそれに適したプライマーの設計が必要となる。プライマーの 設計のポイントを説明し、講義の最後にプライマーの設計の演習を行う。講義の時以外でもプライマーの設計の演習を希望するものは、 どんどん講師の研究室に来て下さい。