組織学研究法概説

解剖学第二講座　山田　久夫

Ｉ顕微鏡用の組織標本作成に関する一般的事項
顕微鏡組織標本は通常、つぎのような手順で作成される。　(1)組織摘出　(2)固定　(3)脱水・包埋　(4)薄切 (5)貼付　(6)染色　(7)脱水・透徹・封入　(8)観察

１　組織摘出　taking out the tissue block
目的臓器の目的箇所を切り出す。極力小さい組織片として切り出した方が、一定した良好な結果が得られる。

２　固定　fixation
組織・細胞を生活状態にあるままで観察できればそれに勝ることはない。しかし、摘出された組織はただちに死後変化を開始する。固定の目的はこの変化を停止させ、一定の構成成分を凝固・沈澱させる（すなわち固定のおもな目的はタンパクの変性である）とともに、一部の物質を溶出させることにより、組織細胞学的検索に適した状態に整えることにある。さらに組織化学では、検出系に用いる活性を保存したまま、目的物質を細胞内に固定させる必要がある。　そこで、染色法に応じて固定液を使い分ける必要がある。

2-1　固定の方法とチャンス

(a) 潅流固定 perfusion： 麻酔下に、生きている動物の心血管系から

(b) 注入固定 infusion： 生体または摘出後の臓器、とくに管腔臓器に対して

(c) 浸漬固定 immersion： 摘出後の組織ブロックを、または、新鮮組織を切片にしてから

(d) 蒸気固定 vapor： 切片、または新鮮臓器（特に凍結乾燥後）の組織小片に

2-2　固定剤の種類

(a) 凝固性のもの

　エタノール、メタノール、アセトン、

　ピクリン酸、

　塩化第二水銀（昇汞）

　クロム酸

(b) 架橋性のもの

　ホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アクロレイン、

　上記アルデヒド類のほか、カルボジイミドなどのタンパク分子架橋剤

(c) その他のもの

　重クロム酸カリウム

　四酸化オスミウム

　酢酸（酢酸は、a b 両者の性格を有する）

2-3　ホルマリンとホルムアルデヒド

(a) ホルマリンとは、40% ホルムアルデヒド溶液のことをさすが、日局方では、35 -37.5%溶液と定められている。（10% formalin = 4% formaldehyde となる）市販のホルマリンは、これに重合阻止剤としてメタノールが(8-10%)加えられてあるほか、酸化されて生じた蟻酸を含んでいる（すなわち酸性に傾いている）。

(b) 中性化ホルマリンとは、市販の 500ml 入りのホルマリン瓶の底に、炭酸カルシウムの粉末を1-2cm の高さになるように投入し、よく混和ののち約１日静置したものである。

(c) 緩衝ホルマリンは、緩衝液で中性化したホルマリンであるが、組織化学に用いる場合は、パラホルムアルデヒドから溶かしたホルムアルデヒド溶液を緩衝液で希釈するのが普通である。

(d) パラホルムアルデヒド paraformaldehyde HO(CH2O)nH は、ホルムアルデヒドの重合体のひとつで白色粉末状のもの。 水に溶けにくいので、アルカリ性の熱水(70-80℃)に溶かしてホルムアルデヒド溶液を得る。（論文中でよく見かける「4%paraformaldehyde溶液にて固定した」という表現は誤りで、「4% formaldehyde 溶液にて固定」とすべきである）。

2-4　よく使われる固定液
上記の固定剤は単独で使用される場合もあるが、数種のものを混和することにより、各々の長所を利用した固定液として使用することが多い。

(a)

10％ホルマリン水溶液　　　汎用

(b)

BOUIN液　　　汎用

　　ホルマリン25ml＋ピクリン酸飽和水溶液75ml＋氷酢酸5ml

(c)

純アセトン　　　血液塗抹や培養の試料に汎用

(d)

純アルコール　　　水溶性物質・糖・粘液などの一般染色、塗抹や培養試料用

　(c)(d)が、0℃以下でも凍らないことを利用して、組織化学に用いる際、新鮮組織小片や切片ないし塗抹または培養試料を、冷凍庫内で浸漬することもある。

(e)

酢酸アルコール　　　各種組織化学と一般組織学に汎用

　　5-10%(ときに30%)酢酸＋60-90%純アルコール

(f)

Carnoy液　　　汎用

　　純アルコール60ml＋クロロホルム30ml＋氷酢酸10ml

(g)

Susa液　　　一般染色用

　　ホルマリン20ml＋昇汞4.5g＋氷酢酸4ml＋食塩0.5g＋三塩化酢酸2g＋水80ml

(h)

Zenker液　　　一般染色用（とくに蛋白）

　　重クロム酸カリ2.5g＋硫酸ナトリウム1g＋昇汞5g＋氷酢酸5ml＋水100ml

(i)

1% glutaraldehyde + 2% formaldehyde + buffer

　　Palay法や Karnovsky法の変法で、一般電顕用に特に推奨される

(j)

4% formaldehyde + 0.2% picric acid + buffer

　　Zamboni法の変法で、免疫組織化学用に特に推奨される

　　0.05-0.5% になるようにglutaraldehydeを加えてもよい

(k)

PLP液　periodate-lysine-paraformaldehyde

　　糖タンパクの免疫組織化学用に開発されたが、この固定液を使う意味がないので最近ほとんど使われていない

　骨・歯等はカルシウム沈着が著しく、硬いので、通常の方法では薄切不可能である。
そこで、固定後（時には固定中）酢酸、三塩化酢酸、硝酸、EDTA等でカルシウムを除去する。

2-5　固定液の性状

(a)

　pH は通常酸性を示している（アルカリ性の固定液はほとんどない）。
組織化学用に緩衝液(pH 7.4)を加えたものでも弱酸性(pH 7.0-7.2)を示す傾向をもつが、それでかまわない。

(b)

　浸透圧は血漿の２〜数倍をしめす。
もし浸透圧が低い場合、sucroseを加えて調整する。

３ 脱水　dehydration・包埋　embedding
薄切に際し、組織片のままでは、組織の柔軟性・硬度のばらつきや空所・間隙の存在等のため均等な厚さの薄い切片を得ることが不可能である。そのため適当な硬度を有した包埋剤を組織に浸透させ、固化・支持してやる。
なお、組織化学や脂肪染色など固定または脱水操作を避けたい場合、未固定または固定試料を凍結・固化し、包埋することなく薄切する（凍結薄切法）。
ビブラトームやマイクロスライサーについても、包埋することなく薄切する。
・パラフィンなど疎水性の包埋剤を用いる場合は、脱水の過程が必要となる。

（脱水剤）

エタノール、ブタノール、アセトン

50％、70％、80％、90％、100％と順次脱水剤の濃度をあげていくことにより、急激な組織の収縮を防ぎながら脱水していく。

（仲介剤）

主としてパラフィン包埋時に、アルコール等の脱水剤とパラフィンの相方に親和性のあるものを用いる。

キシレン、ベンゼン、トルエン、安息香酸メチル、酢酸イソアミル

（包埋剤）

パラフィン（常用）

セロイジン（大型組織、硬組織、厚い切片）

カーボワックス（薄い切片、親水性）

寒天やゼラチン（特殊な凍結薄切用）

エポンその他の合成樹脂（超薄切片または準超薄切片）

OCT-compound（一種の包埋剤、凍結薄切用）

４　薄切　sectioning
一般透過型顕微鏡観察に際して、光線または電子線を透過し、なおかつ組織の重積による像の煩雑さを解消するために、試料は極力薄い切片とされなければならない。（薄切の方法と切片の厚さ）

一般ミクロトーム・パラフィン包埋　（一般用）4〜10μm

一般ミクロトーム・セロイジン包埋　20〜100μm

一般ミクロトーム・凍結試料　20〜100μm

クリオスタット・凍結試料 2〜20μm

クリオスタット・凍結試料（浮遊切片用）＊　15〜数十μm

ビブラトームまたはマイクロスライサー・非包埋＊　10〜1000μm

特殊ミクロトーム・樹脂包埋 （準超薄切片用）1〜2μm

ウルトラミクロトーム・樹脂包埋　（電顕用超薄切片用）50〜70nm

＊「浮遊切片」で染色操作をするためのもの。

凍結試料は固定後でも未固定でもかまわない。

網膜や腸間膜を染色（特に組織化学）する場合、薄切することなくそのまま「浮遊」法で行い、それをwhole-mount preparation（全載標本または伸展標本）とすることができる。

５　貼付
多くの場合薄切後すぐ、浮遊切片法の場合染色操作が終了してから、切片をスライドグラスに貼りつける。　切片はよく伸展させる。
薄い切片では接着剤は不要だが、多くの場合次の接着剤をあらかじめスライドグラスにコーティングしておく。
卵白グリセリン、　ゼラチン、　リジン、　シラン　など

６　染色　staining　（組織化学的染色法は別項で述べる）
光線顕微鏡用標本に用いる染色液の大部分は水溶性である。そこで、染色に先立って疎水性の包埋剤（パラフィンなど）を除去しなくてはならない。（パラフィンの場合の操作としては、キシレンでパラフィンを溶かし、アルコールでキシレンを除去し、水洗することにより親水化する）
6-1 色素について
色素を水溶液とした場合、その有する基により、負または正に荷電する。その荷電状態により酸および塩基性色素に分ける。負が酸性、正が塩基性。

酸性色素　：	細胞質の染色に適す。
	OH, COOH, NO2, SO2OH等の基を有する。
	エオジン、ライト緑、オ−ランチア、酸性フクシン
塩基性色素：	核、粘膜、神経要素、特殊分泌顆粒の染色に用いる。
	NH2, NHCH3, N(CH3)2, NH等の基を有する。
	ヘマトキリン、メチレン青、トルイジン青、アニリン青、チオニン、塩基性フクシン、メチル緑
直接染料であるトリパン青、油溶性色素のsudan系、カルミン色素のアゾカルミンＧなどは、上記のいずれにも属さない。

6-2 一般染色法の例

1)

HE（ヘマトキシリン・エオジン）染色

ヘマトキシリン：青（核）

エオジン　　　：薄赤〜桃色（細胞質）

2)

Azan染色

アゾカルミン　：赤（核、赤血球）

オレンジＧ　　：黄赤（分泌顆粒、コロイド）

アニリン青　　：青（膠原線維、粘液）

3)

Sudan染色

ズダン III　　：橙〜赤（脂肪滴）

ズダン IV 　　：橙（脂肪滴）

ズダン黒　　　：黒（脂肪滴）

4)

PAS(periodic acid schiff)染色

塩基性フクシンを含むschiff液：紫紅〜赤紅（多糖類）

　過ヨウ素酸で糖をアルデヒドにし、schiff試薬をつける

5)

アルデヒドフクシンまたはアルデヒドチオニン染色

アルデヒドフクシン　：濃紫色

アルデヒドチオニン　：深青色

　（下垂体前葉・膵ランゲルハンス島のβ細胞、神経分泌物、弾性線維）　-SS-基や -SH-基を有する物質に色素をつける

6)

クロム反応（染色）

クロム酸カリや 重クロム酸カリ（固定液に加える）：黄褐色〜暗褐色

　（副腎髄質、消化管クロム親性細胞）

7)

鍍銀法（Golgi法、Cajal法、細網線維鍍銀法）

硝酸銀（写真の現像と同じ理論で発色）：褐色〜黒褐色

　（神経細胞、神経線維、細網線維、好銀細胞、親銀細胞）

8)

ギムザ染色　　　塗抹標本などのためのもの

７　脱水 dehydration・透徹 clearing・封入 mounting, cover slipping
封入剤の多くは、水になじまない油溶性である。そこで、包埋の項で述べたと同様の手順で、アルコ−ルにより切片中の水分を除去するとともにキシレンで切片を透明にする。さらに、封入剤を用い切片の透明度を保ち乾燥を防ぎ、カバ−グラスで覆う。

疎水性封入剤

ツェダックス、オイキット、エンテラン（すべて合成樹脂）

Merck社製の "Entellan new" を奬める。

水溶性の封入剤

脂肪染色や組織化学などで、脱水・透徹ができない場合に使用。永久標本にはならない。

グリセリン、グリセリン・ゼリ−、ゴムシロップ

Merck社製の "Aquatex" を奬める。

II　組織細胞化学的手技
組織標本中で特定の物質の局在を明らかにする方法

　１　免疫組織化学
求める物質に対する抗体をあらかじめ作成し、可視化するための標識物質とともに切片に反応させる。　標本作製操作中に抗原性を失活させない、また抗原を露出させるなどの工夫を必要とする。

(a)　抗体の種類

　モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、カクテル抗体、上記３種は右のものほど特異性も感度も高い。

　カクテル抗体とは同一物質の異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体２〜３種を混ぜたもの。

　モノクローナル抗体はエピトープ特異性は高いが、物質特異性と感度ともに低いことに注意する。

(b)　直接法と間接法

求める物質に対する抗体そのもの（第一抗体）に標識する：直接法

反応系を２〜３段階にし、第二以降の反応液に可視化の標識をする：間接法

(c)　可視化標識

酵　素　：	酵素抗体法ともいう。　酵素組織化学の系で発色するperoxidaseがよく用いられる、ほかに、alkaline phosphatase,glucose oxidase, β-galactosidase など
蛍光物質：	蛍光抗体法ともいう。　蛍光顕微鏡で観察する。 FITC、ローダミン、テキサスレッドなど
金　属　：	おもに電顕的免疫組織化学用 金、銀、フェリチンなど
アイソトープ：	特殊な用法

(d)　PAP(peroxidase-antiperoxidase)法、ABC(avidin-biotin-peroxidase complex)法は酵素抗体間接法の一種でよく使用される手技である。

　２　酵素組織化学
　組織中の酵素の検出には、その酵素に対する抗体を用いた免疫組織化学法も適用できるが、酵素活性を利用して基質に発色性をもたせた（発色基質という）酵素組織化学を行うことができる。　固定操作中に酵素活性を失活させないようにする。

　３　蛍光組織化学
　カテコールアミンのように簡単な反応系で蛍光物質に変わるものを蛍光顕微鏡で観察する。もちろんintracellular dye markerとして投与されたものや、他の組織化学の標識に用いた蛍光物質を観察する場合もこれに含める。
　蛍光とは、ある物質に光線があたった時、その波長が長くなる現象であり、その波長差を利用して観察する。　蛍光顕微鏡には落射型のものと透過型のものがある。

　４　レクチン組織化学
　植物種子から抽出された各種のレクチン蛋白が、それぞれ特定の糖残基と結合することを利用した、糖のための組織化学法。

　５　オートラジオグラフィー
　ラジオアイソトープを用いた組織化学法。　ラジオアイソトープをin vivoに投与する場合には、14C-デオキシグルコースをエネルギー源として摂取させfunctional organizationをトレースする方法、細胞内マーカーとして投与する方法、3Ｈ−チミジンや、活性物質とその前駆物質の摂取の有無を追求する方法がある。 in vitroの場合としては、切片にたいして反応させ、アイソトープ標識の生理活性物質のリセプターとの結合を調べるほか、他の組織化学法の標識物質として用いることもある。
　いずれにしても、暗条件下で写真用感光乳剤を切片に塗布し、数日〜数十日後に現像して黒化した銀粒子を観察する。　電顕応用も簡単である。

　６　in situ hybridization法
　核酸が相補的に結合することを利用した組織化学。　あらかじめ目的とする核酸（DNAやRNA、特にmRNAの場合が多い）に相補的なプローブ（cDNAや合成オリゴヌクレオチド、最近ではcRNAも使う）を準備し、それにアイソトープなどで標識し、切片と反応させておこなう。

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Last Updated 2005/8/18