大腸菌や培養哺乳動物細胞への遺伝子導入法は、遺伝子の機能や遺伝子にコードされているタンパクの性質を解明したり、リコンビナントタンパクを大量に得たりする上で、有力な研究手法である。そこで本講義では、大腸菌や培養哺乳動物細胞に遺伝子を導入し、遺伝子にコードされているタンパクやペプチドを発現させる基礎技術について解説する。

A. 大腸菌への遺伝子導入とタンパク発現と精製法

１）どのような発現ベクターを選んだら良いか
　大腸菌に遺伝子を導入してタンパクを発現させる目的で、多くの発現ベクターが開発され販売されている。それぞれのベクターには１長１短があり、自分の研究目的に応じて最適なベクターを選ぶ必要がある。ここでは発現ベクターのいくつかを紹介しながら、ベクター選びの基本的考え方について解説する。
　---＞お薦めベクター

２）発現ベクターへの遺伝子組み込み技術
　発現ベクターへの遺伝子組み込み方法について解説する。通常は、用いる発現ベクターに適応した特定の制限酵素配列を並べたプライマーを利用して、PCR法で目的の遺伝子の両端に組み込み用の制限酵素切断部位を導入する。その後、制限酵素とLigaseを用いて発現ベクターに組み込む。実験を開始する前のプライマー設計時に、トリプレットコドンのフレームに注意したり、３'側に終始コドンを導入したり、融合タンパクとの間に酵素の切断配列を導入したり、十分に検討しておく必要がある。PCR法は、時に核酸配列に間違いが生じることも、注意しておく必要がある。我々は、比較的間違いの少ないKOD Dash Polymrase (Toyobo)などを利用している。
　---＞KOD Dash Ptotocol

３）大腸菌への遺伝子導入からタンパク発現
　発現ベクターに適した大腸菌を選択することが重要である。大腸菌への遺伝子導入は、市販のコンピテント細胞を使えば、それほど困難ではない。タンパク発現は、IPTGにより発現をコントロールする方法が良く用いられている。発現したタンパクの精製には、一般にaffinity chromatographyが用いられることが多いが、融合タンパクの種類によって用いるカラムの種類も方法も異なる。今回は、QUIAGEN社のpQE30ベクターを中心に、具体的方法を紹介しながら解説する。

Ｂ. 培養哺乳動物細胞への遺伝子導入とタンパク発現

１）発現ベクター
　培養哺乳動物細胞に用いる発現ベクターも遺伝子導入技術も、大腸菌に用いるものとは異なる。培養哺乳動物に対する発現ベクターとしては、哺乳動物細胞系で高レベルのタンパク発現を可能にするため、サイトメガロウイルス（CMV）の極初期プロモーターをなどを組み込んでいる。また、培養細胞を生かしたまま蛍光顕微鏡下で遺伝子導入の状態を観察することのできるように、Green Fluorescent Protein（GFP）を同時に発現したり、GFPとの融合タンパクを発現したりするベクターも市販されている。大腸菌に発現させる場合と同じように、自分の研究目的に応じて最適なベクターを選ぶ必要がある。　---＞お薦めベクター2
　どのようなベクターを用いた場合も、かなりきれいに精製しておく必要がある。初心者には、QIAGENのEndFree Plasmid Maxi Kit（Catalog # 12362）がお薦めである。

２）遺伝子導入
　哺乳動物への遺伝子導入は、リポフェクション法が操作が簡便で短時間で終了することから、最も薦められる。最近では、Superfect Transfection Reagent（QIAGEN）など、便利なトランスフェクション用のキットが数社から販売されている。本講義では、その中からキアゲン社のキットを用いてpCMS-EGFPベクターを培養CHO細胞（ハムスターの卵細胞株）に導入し、ラットのアセチルコリン合成酵素を発現させる実験を紹介しながら、培養哺乳動物細胞への遺伝子導入とタンパク発現の基礎的技術について解説する。
　---＞Superfect Transfection Reagent

参考文献：I Tooyama and H Kimura: A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat 17: 217-226, 2000.